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光是一種電磁波具有一定的波長和頻率。可見光的波長范圍在400-760nm，紫外光為200-400mm，紅外光為70-50000m可見光因波長不同呈現(xiàn)不同顏色，這些波長在-定范圍內(nèi)呈現(xiàn)不同顏色的光稱單色光。太陽或鎢絲等發(fā)出的白光是復(fù)合光，是各種單色光的混合光。利用棱鏡可將白光分成按波長順序排列的各種單色光，即紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等，這就是光譜。
有色物質(zhì)溶液可選擇性地吸收一部分可見光的能里而呈現(xiàn)不同顏色，而某些無色物質(zhì)能特征性地選擇紫外光或紅外光的能童。物質(zhì)吸收由光源發(fā)出的某些波長的光可形成吸收光譜，由于物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)不同，對光的吸收能力不同，因此每種物質(zhì)都有特定的吸收光譜，而且在-定條件下其吸收程度與該物質(zhì)的濃度成正比，分光光度法就是利用物質(zhì)的這種吸收特征對不同物質(zhì)進行定性或定里分析的方法。
分光光度計就是利用分光光度法,通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進行定性和定量分析。不同種類的分光光度計的基本原理相似，都是利用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源。光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，通過測量樣品的吸光值，經(jīng)過計算可以轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
分光光度計在追求準(zhǔn)確、快速、可靠的同時，小型化、智能化、 網(wǎng)絡(luò)化成為了現(xiàn)代分光光度計新的特點和發(fā)展點。比如以下對比可以看出：新增加自動波長設(shè)定，波長精度:±1nm大幅度提高，彩色觸摸屏應(yīng)用，功能增加（濃度曲線顯示、多波長設(shè)定）配USB接口等。
常規(guī)技術(shù)參數(shù)：
波長范圍:200-1000nm
波長誤差:±1nm
波長重復(fù)性:≤0.5nm
光譜帶寬:2nm
雜散光:0.1%(T)（在220nm處，以NaI測定）（在360nm處，以NaNO2測定）
透射比范圍：0.0%-200.0%（T）
透射比準(zhǔn)確度：±0.5%（T）
透射比重復(fù)性≤0.2%(T)
噪聲：100%(T)≤0.2%(T)，0%(T)≤0.1%(T)
漂移≤0.002(A)/0.5h（開機2h后，250nm和500nm處）
基線平直度：±0.003(A)(210-990nm)
簡易的操作界面
經(jīng)典分光光度計使用步驟/方法
1)預(yù)熱儀器。為使測定穩(wěn)定，將電源開關(guān)打開，使儀器預(yù)熱20min，為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照。預(yù)熱儀器時和在不測定時應(yīng)將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。
2)選定波長。根據(jù)實驗要求，轉(zhuǎn)動波長調(diào)節(jié)器，使指針指示所需要的單色光波長。
3)固定靈敏度檔。根據(jù)有色溶液對光的吸收情況，為使吸光度讀數(shù)為0.2-0.7，選擇合適的靈敏度。為此，旋動靈敏度檔，使其固定于某一檔，在實驗過程中不再變動。一般測量固定在“1”檔。
4)調(diào)節(jié)“0”點。輕輕旋動調(diào)“0”電位器，使讀數(shù)表頭指針恰好位于透光度為“0”處(此時，比色皿暗箱蓋是打開的，光路被切斷，光電管不受光照)。
5)調(diào)節(jié)T=100%。將盛蒸餾水(或空白溶液或純?nèi)軇?的比色皿放入比色皿座架中的第一格內(nèi)，有色溶液放在其它格內(nèi)，把比色皿暗箱蓋子輕輕蓋上，轉(zhuǎn)動光量調(diào)節(jié)器，使透光度T=100%，即表頭指針恰好指在T=100%處。
6)測定。輕輕拉動比色皿座架拉桿，使有色溶液進入光路，此時表頭指針?biāo)緸樵撚猩芤旱奈舛華。讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。
7)關(guān)機。實驗完畢，切斷電源，將比色皿取出洗凈，并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈。
注意事項
1)為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命。
2)比色皿的使用方法：
①拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。
②清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。如比色皿被有機物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液(1∶2)浸泡片刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿，以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面。每次做完實驗時，應(yīng)立即洗凈比色皿。
③比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干，以保護透光面。
④測定有色溶液吸光度時，一定要用有色溶液洗比色皿內(nèi)壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，以減小測量誤差。
⑤在實際分析工作中，通常根據(jù)溶液濃度的不同，選用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。
被測溶液很少或者很珍貴情況下
微量比色皿是一種由鋁和石英玻璃制成的高質(zhì)量比色皿。 它是對微量高濃度樣品進行測量的完美工具。 超微量比色皿其光程長度為1mm，僅為普通比色皿光程長度的十分之一。 這種比色皿特別適用于高濃度核酸和蛋白質(zhì)樣品的檢測，無需稀釋樣品即可得到高度可重復(fù)性結(jié)果。由于石英玻璃上的疏水性涂層，只需 1.5 µL 核酸或 3 µL 蛋白樣品即可形成液柱。微量比色皿的背景吸光度很低，可保證較寬的樣品檢測范圍。此外只需5µL 樣品溶液即可進行特定熒光檢測，可節(jié)省試劑。
一般情況下，樣品濃度越低，光程長度應(yīng)越長。朗伯比爾定律表明，如果樣品的濃度非常高，所用的光程長度應(yīng)該縮短，以確保足夠的光能透過樣品到達檢測器。對于濃度高于25ng/µL的dsDNA 樣品，建議使用等于或短于1 mm 的光程長度進行微量檢測。
利用比色皿進行濃度測定時，通過樣品特定的消光系數(shù)和光程長度進行計算是最為常用的方法。 對于常規(guī)比色皿，光程長度取決于比色皿的寬度，因為光是水平透過比色皿的。 當(dāng)使用 超微量比色皿時，上下兩部分的距離決定了光程長度。 因此，濃度的檢測和換算和常規(guī)比色皿相同。
部分相關(guān)應(yīng)用
1.核酸定量檢測
2.蛋白質(zhì)直接定量檢測 (UV 280nm)
3.通過微量比色皿對高濃度樣品進行微量檢測
4.細菌生長測定 (OD600)
5.通過比色法進行蛋白質(zhì)定量測定，例如 BCA、Bradford、Lowry 法
6.340 nm： NADPH 或 NADH 測定
7.405 nm： 對硝基苯酚測定
8.490 nm： 細胞毒性測定
9.透光度測定
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